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免疫組化的實驗方法及操作流程
更新時間:2016-09-12   點擊次數(shù):1516次

免疫組化的實驗方法及操作流程
(1)脫蠟和水化

脫蠟前,應(yīng)將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60℃恒溫箱中烘烤20分鐘。

1)組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘,更換二甲苯后再浸泡10分鐘;

2)無水乙醇中浸泡5分鐘;

3)95%乙醇中浸泡5分鐘;

4)70%乙醇中浸泡5分鐘;

(2)抗原修復(fù)

用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片。

1)抗原熱修復(fù)

在沸水中加入EDTA(pH8.0)或0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0)。蓋上不銹鋼高壓鍋的蓋子,但不進行鎖定。將玻片置于金屬染色架上,緩慢加壓,使玻片在緩沖液中浸泡5分鐘,然后將蓋子鎖定,小閥門將會升起來。10分鐘后,去除熱源,置入涼水中,當(dāng)小閥門沉下去后打開蓋子。本方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復(fù)。

2)煮沸熱修復(fù)

電爐或者水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0)至95℃左右,放入組織芯片加熱10~15分鐘。

3)微波熱修復(fù)

在微波爐里加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0)至沸騰后將組織芯片放入,斷電,間隔5~10分鐘,反復(fù)1-2次。適用的抗原有:AR,Bax,Bcl-2,C-fos,X-jun,C-kit,C-myc,E-cadherin,ChromograninA,Cyclin,ER,Heatshockprotein,HPV,Ki-67,MDMZ,p53,p34,p16,p15,P-glycoprotein,PKC,PR,PCNA,ras,Rb,TopoismeraseⅡ等。

4)酶消化方法

常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預(yù)熱至37℃,切片也預(yù)熱至37℃,消化時間約為5~30分鐘;胃蛋白酶消化37℃時間為30分鐘。適用于被固定遮避的抗原,其中有:Collagen,Complement,Cytokeratin,C-erB-2,GFAP,LCA,LN等。

(3)免疫組織化學(xué)染色

常見的染色方法有兩種:SP法,SABC法。以下分別列出兩種方法的實驗步驟。

SP法

1)脫蠟、水化;

2)PBS洗2~3次各5分鐘;

3)3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上,室溫靜置10分鐘

4)PBS洗2~3次各5分鐘;

5)抗原修復(fù);

6)PBS洗2~3次各5分鐘;

7)滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體。

8)滴加Ⅰ抗50μl,室溫靜置1小時或者4℃或者37℃1小時。

9)4℃后需在37℃復(fù)溫45分鐘。

10)PBS洗3次各5分鐘;

11)滴加Ⅱ抗40~50μl,室溫靜置,或37℃1小時;

12)抗中可加入0.05%的tween-20.

13)BS洗3次各5分鐘;

14)DAB顯色5~10分鐘,在顯微鏡下掌握染色程度;

15)PBS或自來水沖洗10分鐘;

16)蘇木精復(fù)染2分鐘,鹽酸酒精分化;

17)自來水沖洗10~15分鐘;

18)脫水、透明、封片、鏡檢。

SABC法

1)脫蠟、水化。

2)PBS洗兩次各5分鐘。

3)用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2,室溫封閉5~10分鐘,蒸餾水洗3次。

4)抗原修復(fù)。

5)PBS洗5分鐘。

6)滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體。

7)滴加Ⅰ抗,室溫1小時或者4℃或者37℃1小時(4℃后在37℃復(fù)溫45分鐘)。

8)PBS洗三次每次2分鐘。

9)滴加生物素化二抗,20℃~37℃20分鐘。

10)PBC洗3次每次2分鐘。

11)滴加試劑SABC,20℃~37℃20分鐘。

12)PBS洗4次每次5分鐘。

13)DAB顯色:DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色(鏡下掌握顯色程度)。

14)蒸餾水洗。蘇木素復(fù)染2分鐘、鹽酸酒精分化。

15)脫水、透明、封片、鏡檢。

 

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